Perhitungan Bakteri Dengan Metode Hitungan Cawan

PERHITUNGAN BAKTERI DENGAN METODE HITUNGAN CAWAN

Ita Apriani

C14090019

1.1              Latar Belakang

Organisme mikroskopis adalah organisme yang hanya bisa dilihat dengan menggunakan mikroskop. Salah satunya adalah bakteri yang merupakan organisme mikroskopis. Keadaan bakteri di alam ini ada yang bersifat menguntungkan dan ada yang bersifat merugikan bagi kepentingan manusia. Bakteri yang menguntungkan dan merugikan bagi kepentingan organisme akuatik perlu dipelajari  supaya bakteri yang menguntungkan, keberadaannya (kapasitas jumlahnya) dapat diperbanyak sedangkan untuk bakteri yang merugikan (patogen) jumlah populasinya dapat ditekan dan dapat dilakukan tindakan pencegahan atau antisipasi  infeksi bakteri tersebut (Umam, 2008).

Setelah kita mempelajari bagaimana menumbuhkan suatu koloni bakteri, tentu harus mengatahui kuantitas dan kualitas dari bakteri tersebut. Dalam hal ini yang akan dibahas adalah bagaimana mengetahui kuantitas dari suatu bakteri. Ada berbagai cara untuk menghitung jumlah sel bakteri, antara lain hitungan langsung dengan menggunakan mikroskop, dan hitungan tidak langsung dengan metode hitung cawan baik dengan metode cawan tuang maupun metode cawan sebar.

Pengukuran kuntitatif populasi mikroba dari suatu sampel dilakukan untuk mengetahui kualitas bahan atau tujuan lain berdasarkan jumlah mikroba yang ada dalam sampel tersebut. Sehingga dengan kita dapat mengetahui apakah mikroba tersebut berbahaya atau bahkan baik bagi lingkungan dalam jumlah tertentu.

1.2              Tujuan

Mempelajari cara melakukan pengenceran serial dan menentukan jumlah bakteri dalam suatu sampel dengan metode hitungan cawan.

I.                   METODOLOGI

1.1              Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu, tanggal 27 April 2011 pada pukul 12.00-15.00 WIB, bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan, dan dilakukan pengamatan pada hari kamis, tanggal 28 April 2011 pukul 14.00-15.00 WIB di R. Gam, Departemen Budi Daya Perairan, Institut Pertanian Bogor.

1.2              Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah rak tabung reaksi, pipet 1 ml yang steril, cawan petri kosong yang steril, bunsen, alkohol 95%, alkohol 75%, tissue, korek api dan bunsen. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah suspensi bakteri Pseudoalteromonas sp. tabung berisi 12 ml media SWC cair bersuhu 50^oC, tabung berisi 9 ml larutan fisiologis (0,85% NaCl), dan media SWC dalam cawan petri.

1.3              Prosedur Kerja

Tabung berisi garam fisiologis disiapkan dan disusun berderet. Sampel suspensi bakteri dikocok dengan baik sampai kekeruhannya merata. Kemudian dilakukan pengenceran serial sampel suspensi bakteri dan ambil secara aseptik 1 ml suspensi bakteri lalu dimasukkan kedalam tabung 9 ml pertama, dikocok agar homogen. Lalu secara aseptik dipipet 1 ml sampel dari tabung pengencer kedua, dan seterusnya untuk tabung pengencer selanjutnya. Kemudian disiapkan 3 cawan petri steril dan 3 cawan petri berisi media SWC, beri kode sesuai dengan kode tabung pengencer yang akan dituang/disebar. Kemuadian dipipet 0.1 ml sampel dari tabung pengencer 5, 4 dan 3 lalu disebar pada media SWC menggunakan batang penyebar. Pipet 0.1 ml sampel dari tabung 5, 4, dan 3 sekali lagi lalu dituang ke dalam cawan petri steril kemudian ditambahkan media SWC cair dan selanjutnya digoyang secara perlahan. Agar dibiarkan dalam cawan supaya padat, setelah itu diletakan dalam posisi terbalik untuk diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Kemudian dihitung jumlah koloni yang tumbuh (30-300) dan dikalikan dengan faktor pengencernya.

II.                HASIL DAN PEMBAHASAN

2.1              Hasil

Berdasarkan hassil pengamatan yang telah dilakuakn, diperoleh data sebagai berikut :

Tabel 1. Hasil pengamatan perhitungan bakteri

Hasil Kelompok	Metode	10-3 cfu/ml	10-4 cfu/ml	10-5 cfu/ml	Keterangan
					10-3	10-4	10-5
VII	Cawan Tuang	TBUD	1,52 x 107	TBUD	-	-	-
	Cawan Sebar	TBUD	2,5 x 105	5,2 x 104	-	-	-
VIII	Cawan Tuang	0	TBUD	0	-	-	-
	Cawan Sebar	TBUD	TBUD	31 x 106	-	-	-
IX	Cawan Tuang	TBUD	74 x 105	0	-	-	+
	Cawan Sebar	TBUD	TBUD	0	-	-	+
X	Cawan Tuang	134 x 104	24 x 105	13 x 106	+	+	+
	Cawan Sebar	TBUD	TBUD	9 x 106	-	-	+
XI	Cawan Tuang	0	0	0	-	+	-
	Cawan Sebar	0	0	3,3 x 105	-	-	+
XII	Cawan Tuang	TBUD	291 x 105	0	-	+	-
	Cawan Sebar	218 x 104	0	0	+	-	-

Keterangan :   +   = Kontaminan

-           = Tidak kontaminan

TBUD     = Tidak Bisa Untuk Dihitung

Berdasarkan tabel 1 di atas, rata-rata menunjukkan hasil yang sama yakni jumlah koloni akan semakin berkurang. Tabung 1 (10^-3 cfu/ml) > tabung 2 (10^-4 cfu/ml ) > tabung 3 (10^-5 cfu/ml ) karena jumlah konsentrasi bakteri yang semakin sedikit akibat adanya proses pengenceran.

Contoh perhitungan :

Jumlah Sel Bakteri  = ∑ koloni x 1/faktor pengenceran x 1/volume

                                = 33 x 1/10^-5 x 1/^10-1

                                = 3.3 x 10⁵ cfu/ml.

2.2              Pembahasan

Pseudoalteromonas sp. pertama kali terisolasi dari alga laut di lingkungan pesisir laut. Bakteri ini termasuk bakteri gram negatif yang dapat ditemukan di laut  seluruh dunia, bergerak dengan alat satu flagellum di ujung/kutub yang membantu untuk bergerak bolak-balik antara solid permukaan laut dan perairan terbuka dalam mencari sumber makanan. Tipe sel bakteri biasanya satu atau berpasangan serta memperoleh energi melalui mekanisme kemoorganotrofik. Kemoorganotrofik membentuk biofilm-bakteri yang penting untuk bioremidiasi. Biofilm penting dalam pengendalian konsentrasi logam beracun dalam lingkungan laut karena dapat menyerap 20-40% dari tumpahan logam timah (Jakcob, 2006).

Berikut ini adalah Pseudoalteromonas atlantica yang merupakan salah satu spesies yang termasuk ke dalam genus Pseudoalteromonas sp. :

Kingdom         : Bacteria

Phylum            : Proteobacteria

Kelas               : Gammaproteobacteria

Ordo                : Alteromonadales

Family             : Pseudoalteromonadaceae

Genus              : Pseudoalteromonas sp.

Spesies            : Pseudoalteromonas atlantica

Pseudoalteromonas atlantica biasanya ditemukan berinteraksi antara eukaryot dan laut, seperti kepiting dan rumput laut. Genus P.  atlantica sangat sekuen karena produksi asam amino polisakarida ekstraseluler selama pembentukan biofilm yang menunjukkan potensi daur ulang elemen, detoksifikasi, dan bahan-bahan untuk produksi makanan. P. atlantica juga merupakan agar-decomposing bakteri yang memproduksi agarase yang banyak digunakan sampai sekarang, karena P. atlantica dapat dibuat secara komersial. P. atlantica adalah psikothrofik dan kemoorganotrofik. Hal ini mampu merombak molekul organik menjadi anorganik  untuk metabolisme dan menghasilkan energi, tetapi bakteri ini tidak melakukan fermentasi. Beberapa molekul penting yang dihasilkan adalah acidic extracellular polysaccharide (EPS), enzim (agarase, agar hidrolase, alginat, dan karagenan), signaling molekul (homoserin laktones dan protease). EPS diproduksi dalam jumlah besar untuk konsentrasi dan memberikan substrat gizi di dalam biofilm bagi mikroorganisme laut lainnya. P. atlantica memperoleh energi untuk produksi EPS dari koloni padat di permukaan dengan cepat, dengan mensekresikan enzim dapat memproses dan mengambil substrat. kemampuan menarik lainnya dari bakteri ini adalah memiliki kemampuan untuk mengambil alih adhesin melalui pertukaran dan ini sangat penting untuk siklus kehidupan bakteri karena perlu bermigrasi dari laut ke permukaan yang solid. Adhesins akan dinonaktifkan bila bakteri cadangan makanan cukup ketika ke permukaan dan dalam perjalanan laut. Setelah permukaan yang baik dan cocok ditemukan, bakteri adhesin diperlukan untuk tambahan makanan. Dan dimulai untuk membentuk biolfilms (Jakcob, 2006).

P.  atlantica yang tidak mampu menggunakan DL-Malate, D-sorbitol, atau m-hydroxybenzoat untuk metabolisme katabolik, hal ini mampu hidrolisis gelatin. Gelatin adalah protein yang mengandung asam amino esensial dan berasal dari hidrolisis dari kolagen dari sumber-sumber alam. Bakteri ini menguraikan gelatin polimer asam amino ke dalam individu untuk gizi. P. atlantica dapat menyebabkan infeksi penyakit shell edible kepiting. Studi menunjukkan bahwa produk eksrtaseluler atau ECP yang diproduksi oleh P. atlantica cepat menyebabkan kematian bila disuntikkan ke kepiting sehat. Tidak ada studi yang menunjukkan bahwa P.  atlantica merugikan atau pathogen terhadap manusia (Jakcob, 2006).

Menurut Pelczar (1986) untuk mendapatkan koloni mikroba dapat dilakukan dengan berbagai metode, salah satunya dengan menggunakan metode cawan tuang maupun cawan sebar. Setelah didapatkan koloni yang tumbuh pada suatu media agar, kemudian kita juga dapat mengetahui jumlah koloni bakteri yang tumbuh setelah proses inkubasi selama 24 jam. Metode yang dilakukan pada praktikum kali ini yaitu metode cawan sebar dan cawan tuang. Metode ini dianggap lebih baik, dan akurat bila dibandingkan dengan menghitung jumlah bakteri secara langsung menggunakan mikroskop karena metode hitungan cawan hanya menghitung jumlah bakteri yang hidup dan yang membentuk koloni saja, sedangkan yang mati tidak ikut terhitung. Selain itu metode ini lebih mudah dan praktis. Kelemahannya yakni membutuhkan banyak bahan, media yang digunakan adalah media SWC (Sea Water Complete) yang digunakan untuk sampel bakteri dari air laut yakni Pseudoalteromonas sp. yang dapat tumbuh pada lingkungan laut sehingga dapat dengan mudah ditumbuhkan di media SWC, dan selanjutnya dapat dihitung jumlah koloni yang tumbuh.

Metode cawan tuang (pour plate)  mudah dilakukan karena tidak membutuhkan keterampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui beratnya ke dalam 9 ml garam fisiologis (NaCl 0.85%) atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagi penyangga pH agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Pengenceran dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (nutrien agar) steril hangat (40-50^oC) kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator (37^oC) selama 24 jam. Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjadi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak diinginkan. Media yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan, media panas masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. Pada metode ini koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator (Riesama, 2010).

Metode cawan sebar (spread plate) sebar, 0.1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan disebar pada media penyubur steril yang telah disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan dengan batang penyebari agar koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian diletakkan dalam inkubator (37^oC) selama 24 jam. Metode ini cukup sulit terutama saat meratakan suspensi dengan batang penyebar. Oleh karena itu, batang penyebar harus benar-benar steril, yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu dalam alkohol kemudian dipanaskan dengan api bunsen. Batang penyebar yang masih panas akibat pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar, sehingga harus didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya di sekitar api bunsen (±15 cm). Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang menjadi satu koloni bakteri. Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan permukaan koloni (Riesama, 2010).

Hasil pengamatan jumlah koloni bakteri yang ditunjukkan pada tabel diatas menyatakan tidak semua cawan koloni bakterinya dapat dihitung atau disebut  TBUD (tidak bisa untuk dihitung) dan ada yang hasilnya nol karena jumlah koloni kurang dari 30. Hasil TBUD secara umum paling banyak terjadi pada tabung nomor 1 (10^-3 cfu/ml) karena faktor pengenceran dan konsentrasi bakteri di dalam suspensi masih banyak. Ketika jumlah sampel yang dipipet sedikit serta ketika pemipetan yang terambil hanya larutannya saja (bukan bakterinya), karena suspensi tidak teraduk secara merata menyebabkan jumlah mikroba yang diencerkan kurang sehingga begitu disebar atau dituang menghasilkan jumlah koloni kurang dari 30 koloni sehingga dinyatakan tidak tumbuh dan bernilai nol. Tapi berdasarkan tabel diatas, rata-rata menunjukkan hasil yang sama yakni jumlah koloni akan semakin berkurang dari tabung 1 (10^-3 cfu/ml), tabung 2 (10^-4 cfu/ml ) dan tabung 3 (10^-5 cfu/ml ) karena jumlah konsentrasi bakteri yang semakin sedikit akibat adanya proses pengenceran. Pengenceran sendiri dapat berhasil apabila semakin besar pengenceran dilakukan maka jumlah koloni yang tumbuh akan semakin sedikit terkait dengan semakin berkurangnya konsentrasi bakteri.

 

I.                   KESIMPULAN DAN SARAN

1.1              Kesimpulan

Penghitungan bakteri dengan metoda hitungan cawan dilakukan karena mempunyai kelebihan yakni mudah dan efektif dalam proses penghitungan mikroba dan juga bakteri yang dihitung adalah bakteri yang tumbuh saja. Sedangkan kekurangannya yakni bahan yang digunakan relatif lebih banyak. Hasil pengenceran bakteri dapat dikatakan berhasil karena semakin besar pengencerannya maka jumlah koloni bakteri yang tumbuh akan semakin kecil terkait konsentrasi bakteri yang semakin kecil pula, namun jumlah bakteri yang tumbuh semakin besar karena dikalikan dengan faktor pengencernya. Dari hasil praktikum diperoleh jumlah bakteri pada tabung 3 pada pengenceran 10^-5 cfu/ml sebesar 31 x 10⁶, sedangkan pada tabung 1 (10^-3 cfu/ml) sebesar 134 x 10⁴ , dan tabung 2 (10^-4 cfu/ml) sebesar 291 x 10⁵.

1.2              Saran

Penghitungan bakteri dengan metode hitungan cawan dilakukan menggunakan isolat bakteri yang beragam, sehingga dapat dengan mudah mengetahui jumlah berbagai macam koloni bakteri.

  

DAFTAR PUSTAKA

Jakcob. 2006. Pseudoalteromonas sp. dan Pseudoalteromonas Atlantica T6  [terhubung berkala] http://genome.jgipsf.org/finished_microbes/pseat/pseat.home.html. (1 Mei 2011).

Pelczar MJJr, Chan ECS. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Volume 1. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah; Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.

Riesma. 2010. Perhitungan bakteri [terhubung berkala] http://riesama.blog.friendster.com/dunia-mikrobiologi/ (1 Mei 2011).

Umam, AH. 2008. Perhitungan jumlah bakteri pada suatu bahan. [terhubung berkala]http://www.scribd.com/doc/15564954/8317266pertumbuhanbakteri (1 Mei 2011)