Penyiapan Medium dan Sterilisasi Bahan dan Peralatan

PENYIAPAN MEDIUM DAN STERILISASI BAHAN DAN PERALATAN

Ita Apriani

C14090019

            1.1  Latar Belakang

Untuk menelaah bakteri di laboratorium, kita harus dapat menumbuhkan atau mengembangkan bakteri tersebut. Adanya pembiakan bakteri dimaksudkan untuk memudahkan pemeriksaan yang akan dilakukan di dalam laboratorium, sehingga jika sewaktu-waktu diperlukan bakteri untuk suatu percobaan, maka bakteri tersebut telah tersedia. Biakkan bakteri  tersebut dapat disimpan di dalam lemari es untuk waktu yang lama tanpa ada kerusakan (Caray, 2009).

Keragaman yang luas dalam hal tipe nutrisi dianatara mikroorganisme diimbangi oleh tersedianya berbagai media yang banyak macamnya untuk kultivasinya. Macam media yang tersedia dapat dikelompokkan dengan berbagai cara. Selain menyediakan nutrien yang sesuai untuk kultivasi mikroorganisme, juga perlu disediakan kondisi fisik yang memungkinkan pertumbuhan optimum. Mikroorganisme tidak hanya bervariasi dalam persyaratan nutrisinya, tetapi juga menunjukkan respons yang berbeda-beda terhadap kondisi fisik di dalam lingkungannya ( Caray, 2009).

Sebelum digunakan sebagai medium pertumbuhan, harus dilakukan sterilisasi medium yang akan membunuh bakteri dan mikroorganisme lain yang mungkin terkandung atau mengkontamikasi. Untuk mencapai tujuan ini dapat dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave dengan memanaskan hingga suhu 121^oC selama kursng lebih 15 menit pada tekanan 1 atm. Kadang terdapat komponen medium yang sensitif panas sehingga tidap dapat dilakukan sterilisasi menggunakan autoclave, sterilisasi komponen tersebut dapat dilakukan dengan menggunakan kertas saring yang memeliki pori-pori 45 mikro. Kertas saring ini akan menahan sel dan endospora yang mungkin ada sehingga komponen dapat ditambah pada medium yang sudah mengalami sterilisasi panas (Inforedia, 2009). 1.2  Tujuan 

Tujuan praktikum ini adalah mempelajari prosedur umum untuk merekonstitusi (mengembalikan dalam keadaan asalnya) medium berbentuk bubuk (terdehidrasi) dan menaruhnyaa dalam jumlah dikehendaki ke dalam wadah-wadah yang sesuai. Selain itu mempelajari berbagai macam prosedur sterilisasi bahan dan peralatan.

PEMBAHASAN

Medium adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di dalamnya. Macam-macam medium berdsarkan konsistensinya dibagi menjadi 3 jenis; medium padat, medium setengah padat, dan medium cair. Medium padat berfungsi untuk menumbuhkan bakteri yang dapat diamati penampilan atau morfologi koloni. Misalnya, tubuh buah mikrobakteri dan endospora spesies-spesies tertentu. Medium setengah padat mengandung zat pembentuk gel berkonsentrasi rendah dan mempunyai konsistensi menyerupai jeli. Medium semacam ini berguna untuk membiakan bakteri mikroaerofil dan juga untuk menelaah berbagai aspek motilitas dan kemotaksis. Sedangkan medium cair digunakan untuk berbagai keperluan seperti pembiakan organisme dalam jumlah besar (Hadiutomo, 2009).

 Komposisi pembuatan agar TSA adalah kasein yang diuraikan secara pankreatik USP 17 g, bungkil kedele yang diuraikan dengan papain USP 3 g, NaCl 5 g, pepton 5 g, dan air suling 1.000 ml. Komposisi pembuatan agar TCBS adalah natrium tiosulfat 10 g, natrium sitrat 10 g, oxgall 5 g, natrium kolat 3 g, sukrosa 20 g, kasein yang diuraikan secara pankreatik USP 5 g, jaringan hewan yang diuraikan secara peptik USP 5 g, ekstrak khamir 5 g, NaCl  10 g, besi sitrat 1 g, biru timol 0,04 g, biru bromotimol 0,04 g, agar 14 g, air suling 1.000 ml. Komposisi pembuatan agar TSB adalah kasein yang diuraikan secara pankreatik USP 17 g, bungkil kedele yang diuraikan dengan papain USP 3 g, NaCl 5 g, K₂HPO₄ 2,5 g, glukosa 2,5 g, dan air suling 1.000 ml. (Hadiutomo, 2009).

Bentuk media kultur yang dapat dibuat dengan derbagai macam cara diantaranya: 1). tabung broth adalah tabung yang berisi medium cair. Mediun ini berisi nutrien tertentu yang berfungsi sebagai substrat pertumbuhan mikrobia, misalnya kasein, NaCI dan air. 2). agar miring adalah tabung yang berisi nutrien dan agar. Medium dibiarkan memadat pada salah satu ujung sehingga diperoleh permukaan miring yang rata. 3). Plate agar merupakan cawan petri streril yang secara aseptis berisi medium agar cair steril yang dibiarkan memadat. Hal ini biasa digunakan untuk metode pengkulturan, pemisahan dan perhitungan mikrorganisme. Koloni mikroorganisme ini akan memunculkan kenampakan tertentu pada cawan petri setelah masa inkubasi tertentu yang akan tumbuh pada goresan (streaking) yang kemudian akan memunculkan koloni tunggal (Inforedia, 2009).

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992). Sterilisasi merupakan metode praktis yang dirancang untuk membersihkan dari mikroorganisme, atau sengaja untuk menghambat pertumbuhannya yang nyata dari kepentingan dasar di banyak keadaan. Jenis dari mikroorganisme sangat berbeda dalam kelemahannya. Terdapat berbagai macam agen antimikroba, dan lebih banyak lagi, afek yang praktis dari agen ini pada adanya keadaan nyata yang sangat besar dipengaruhi oleh keadaan sekitar. Banyak yang akan bertahan, contohnya, pada cuaca tertentu organisme memiliki kulit, pada beberapa tubuh zat cair atau pada udara, Air, makanan, kotoran, atau ruangan berdebu. Caranya harus dirubah, oleh karena itu, dengan masalah nyata. Hal ini tidak mungkin, bagaimanapun pada garis besarnya tentunya prinsip dasar digaris bawahi pada umumnya digunakan cara untuk memusnahkan dan mengontrol kehidupan mikroba (Burdon dalam inforedia, 2009).

Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi. Jika sterilisasi berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk paling resisten dari kehidupan mikrobia akan diluluhkan (Lay dan Hastowo, 1992). Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu panas, penyaringan, radiasi, dan penambahan bahan kimia. Sedangkan sterilisasi dengan cara panas dapat dilakukan dengan panas basah, panas kering, pemanasan bertahap dan perebusan.

1.      Pemanasan basah

Pemanasan basah adalah sterilisasi panas yang digunakan bersama-sama dengan uap air. Pemanasan basah biasanya dilakukan didalam autoklaf atau sterilisator uap yang mudah diangkat dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan pada suhu 121⁰C selama 15 menit (Hadioetomo, 1985). Cara pemanasan basah dapat membunuh jasad renik atau mikroorganisme terutama karena panas basah dapat menyebabkan denaturasi protein, termasuk enzim-enzim didalam sel (Fardiaz, 1992).

2.      Pemanasan kering

Dibandingkan pemanasan basah, pemanasan kering kurang efisien dan membutuhkan suhu yang lebih tinggi serta waktu lama untuk sterilisasi. Hal ini disebabkan karena tanpa kelembaban maka tidak ada panas laten (Hadioetomo, 1985). Pemanasan kering dapat menyebabkan dehidrasi sel dan oksidasi komponen-komponen di dalam sel (Fardiaz, 1992). Keuntungan dari pemanasan kering adalah tidak adanya uap air yang membasahi bahan atau alat yang disterilkan, selain itu peralatan yang digunakan untuk sterilisasi uap kering lebih murah dibandingkan uap basah (Lay dan Hastowo, 1992). Pemanasan kering sering dilakukan dalam sterilisasi alat-alat gelas di laboratorium, dimana menggunakan oven dengan suhu 160-180⁰C selama 1,5-2 jam dengan sistem udara statis (Fardiaz, 1992).

3.      Pemanasan bertahap

Pemanasan bertahap dilakukan bila media atau bahan kimia tahan terhadap uap 100⁰C (Lay dan Hastowo, 1992). Pemanasan bertahap (tindalisasi) dilakukan dengan cara memanaskan medium atau larutan menggunakan uap selama satu jam setiap hari untuk tiga hari berturut-turut. Waktu inkubasi diantara dua proses pemanasan sengaja diadakan supaya spora dapat bergerminasi menjadi sel vegetatif sehingga mudah dibunuh pada pemanasan berikutnya (Fardiaz, 1992).

4.      Perebusan

Perebusan adalah pemanasan didalam air mendidih atau uap air pada suhu 100⁰C selama beberapa menit (Fardiaz,1992). Pada suhu ini sel vegetatif dimatikan, sedang spora belum dapat dihilangkan (Lay dan Hastowo, 1992). Beberapa bakteri tertentu tahan terhadap suhu perebusan ini, misalnya Clostridium perfringens dan Clostridium botulinum tetap hidup meskipun direbus selama beberapa jam (Lay dan Hastowo, 1992)

5.      Penyaringan

Penyaringan adalah proses sterilisasi yang dilakukan pada suhu kamar. Sterilisasi dengan penyaringan digunakan untuk bahan yang peka terhadap panas misalnya serum, urea dan enzim (Lay dan hastowo, 1992). Dengan cara penyaringan larutan atau suspensi dibebaskan dari semua organisme hidup dengan cara melakukannya lewat saringan dengan ukuran pori yang sedemikian kecilnya sehingga bakteri dan sel-sel yang lebih besar tertahan diatasnya, sedangkan filtratnya ditampung didalam wadah yang steril (Hadioetomo,1985).

6.      Radiasi ionisasi 

Radiasi ionisasi adalah radiasi yang mengandung energi yang jauh lebih tinggi daripada sinar ultraviolet. Oleh karena itu mempunyai daya desinfektan yang lebih kuat. Salah satu contoh radiasi ionisasi adalah sinar gamma yang dipancarkan dari kobalt-10 (Fardiaz, 1992). Radiasi dengan sinar gama dapat menyebabkan ion bersifat hiperaktif (Lay dan Hastowo, 1992).

7.      Radiasi sinar ultra violet

Sinar ultra violet dengan panjang gelombang yang pendek memiliki daya antimikrobial yang sangat kuat. Daya kerjanya adalah absorbsi oleh asam nukleat tanpa menyebabkan kerusakan pada permukaan sel. Kerusakan tersebut dapat diperbaiki bila disinari dengan berkas yang mempunyai gelombang yang lebih panjang (Lay dan Hastowo, 1992).

8.      Penambahan bahan kimia

Menurut Lay dan Hastowo (1992), bahan yang menjadi rusak bila disterilkan pada suhu yang tinggi dapat disterilkan secara kimiawi dengan menggunakan gas. Bahan kimia yang sering digunakan antara lain : 1) Alkohol, daya kerjanya adalah mengkoagulasi protein. Cairan alkohol yang umum digunakan berkonsentrasi 70-80 % karena konsentrasi yang lebih tinggi atau lebih rendah kurang efektif. 2) Khlor, Gas khlor dengan air akan menghasilkan ion hipokloride yang akan mengkoagulasikan protein sehingga membran sel rusak dan terjadi inaktivasi enzim. 3) Yodium, daya kerjanya adalah bereaksi dengan tyrosin, suatu asam amino dalam emzim atau protein mikroorganisme. 4) Formaldehida 8 % merupakan konsentrasi yang cukup ampuh untuk mematikan sebagian besar mikroorganisme. Daya kerjanya adalah berkaitan dengan amino dalam protein mikrobia. 5) Gas etilen oksida, gas ini digunakan terutama untuk mensterilkan bahan yang dibuat dari plastik.

Sterilisasi dengan bahan kimia digunakan alkohol 70 %. Menurut Gupte (1990), etil alkohol sangat efektif pada kadar 70 % daripada 100 % dan ini tidak membunuh spora. Sterilisasi dengan alkohol dilakukan pada proses pembuatan kultur stok dan teknik isolasi. Alkohol 70 % disemprotkan pada tangan praktikan dan alat-alat seperti makropipet dan mikropipet. Menurut Volk dan Wheeler (1988), alkohol bila digunakan pada kulit kontaknya terlalu pendek untuk menimbulkan banyak efek germisida dan alkohol segera menguap karena sifatnya mudah menguap. Namun alkohol dapat menyingkirkan minyak, partikel debu, dan bakteri. Menurut Gupte (1990), alkohol 70 % dapat menyebabkan denaturasi protein dan koagulaasi. 

Berdasarkan hasil pengamatan yang diperoleh, penyiapan medium tidak menimbulkan kontaminan bakteri sehingga proses sterilisasi bahan dan peralatan dapat dikatakan berhasil. Medium steril adalah medium yang tidak mengandung semua jenis kehidupan, yang biasanya disterilkan dengan memanaskan pada temperatur tertentu sehingga semua mikroorganisme pengkontaminasi dimatikan. Akhirnya, dalam bekerja dengan mikroorganisme harus dibuat cara untuk memindahkan organisme yang tumbuh (yang disebut inokulum) dari suatu kultur murni ke medium. Medium steril tanpa terjadi pemindahan kontaminan luar yang tidak diinginkan. Metode untuk mencegah masuknya mikroorganismeyang tidak dikehendaki disebut teknik aseptik. Dengan teknik aseptik maka tidak terjadi introdiksi organisme kontaminan ke dalam kultur. Hal ini juga menjamin organisme yang sedang ditangani tidak mengkontaminasi orang yang ada di sekitar. Sterilisasi merupakan suatu proses yang bertujuan untuk menghilangkan dan membebaskan semua alat dan media dari gangguan organisme mikroba, termasuk virus, bakteri, spora dan fungi beserta sporanya. Sterilisasi merupakan suatu metode atau cara yang digunakan untuk mengeliminasi semua mikroorganisme (Greenwood dalam Oktarina, 2009).