ISOLASI BAKTERI DARI LINGKUNGAN AKUAKULTUR

  

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

            Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme mikroskopik yang sebagian besar berupa satu sel yang terlalu kecil untuk dapat dilihat menggunakan mata telanjang. Mikroba berukuran sekitar seperseribu milimeter (1 mikrometer) atau bahkan kurang, walaupun ada juga yang lebih besar dari 5 mikrometer. Karenanya, mikroba hanya bisa dilihat dengan menggunakan alat bantu berupa mikroskop (Admin, 2008).

            Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.

            Menurut Idafi (2009) metode yang umumnya digunakan untuk mengisolasi bakteri dan fungi ada 3 macam yaitu metode cawan gores, metode cawan sebar, dan metode cawan tuang. Ketiga metode ini dapat memisahkan selsel yang berbeda, namun metode yang paling sering digunakan yaitu metode cawan gores. Setelah media digores dan diinkubasi selama 18-24 jam terbentuklah

massa sel yang dinamakan koloni.

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah mempelajari cara mengisolasi bakteri dari lingkungan akuatik dengan menggunakan metode penggoresan kuadran serta mengamati ciri-ciri koloni bakteri tumbuh.

II. METODOLOGI

2.1 Waktu dan Tempat

            Praktikum ini dilaksanakan pada hari Selasa, 8 Oktober 2013 pada pukul 07.00-10.00 WIB bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

2.2 Alat dan Bahan

          Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tube, bunsen, cawan petri,

plastik, ose, wrap, spidol, penggaris, dan inkubator. Kemudian bahan yang

digunakan dalam praktikum ini yaitu biakan murni bakteri Eschericia coli, Vibrio alginoliticus, Pseudoalteromonas, strain Staphylococcus aureus, media TSA, media SWC, media TCBS, media EMBA, alkohol 70%, dan akuades.

2.3 Prosedur Kerja

            Prosedur kerja pada praktikum ini adalah sebagai berikut, cawan petri yang berisi media diletakkan pada meja yang sudah dibersihkan dengan alkohol. Kemudian media dibalik dan dengan dibagi menjadi empat bagian yaitu 0, I, II, dan III (Gambar 1). Setelah itu ose dipanaskan dengan api bunsen sampai berpijar, lalu ditunggu sampai tidak terlalu panas kemudian dicelupkan pada sampel dan digoreskan pada media sektor 0, selanjutnya ose dipanaskan kembali dan ditunggu sampai tidak terlalu panas kemudian digoreskan dari bagian tepi sektor 0 sampai pada bagian sektor I, sehingga bakteri yang ada pada sektor 0 akan tersebar pada sektor I, dan demikian seterusnya sampai sektor III. Kemudian semua media diinkubasi pada suhu ruang selama ± 24 jam.

Gambar 1. Pembagian sektor kuadran dari permukaan luar dasar cawan

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil

            Hasil pengamatan isolat bakteri yang dapat diisolasi dari lingkungan akuatik disajikan pada tabel di bawah ini.

Tabel 1. Hasil pengamatan isolat bakteri dan fungi yang berhasil diisolasi dari

              lingkungan akuatik

Media	Warna	Bentuk	Elevasi	Tepian
EMBA	Pink keunguan	Bulat	Cembung	Entire/Licin
TSA (1)	Putih	Bulat	Cembung	Entire/Licin
TSA (2)	Putih	Bulat	Cembung	Entire/Licin
TCBS	Kuning dan Hijau	Bulat	Cembung	Entire/Licin
SWC (1)	Orange	Bulat	Cembung	Entire/Licin
SWC (2)	Orange	Bulat	Cembung	Entire/Licin

                Bakteri yang ditumbuhkan

                EMBA   = Eschericia coli

                TSA        = Staphylococcus aureus

                TCBS     = Vibrio alginoliticus

                SWC       = Pseudoalteromonas

           

            Berdasarkan Tabel 1 diketahui bahwa media EMBA dengan isolate bakteri Eschericia coli memiliki warna pink keunguan, media TSA yang ditumbuhi oleh bakteri Staphylococcus aureus memiliki warna koloni putih, media TCBS dengan isolate bakteri Vibrio alginoliticus memiliki warna koloni kuning kehijauan, sedangkan media SWC yang ditumbuhi oleh bakteri Pseudoalteromonas memiliki warna koloni orange. Dari keseluruhan isolate bakteri yang digunakan memiliki bentuk bulat, elevasi cembung, dan tepian licin.

3.2 Pembahasan

            Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan satu sel tunggal. Biakan murni diperlukan karena semua metode mikrobiologis yang digunakan untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroba, termasuk penelaahan ciri-ciri kultur, morfologis, maupun serologis memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroba (Waluyo dalam Iman, 2010). Karakteristik koloni bakteri hasil inokulasi merupakan salah satu bagian dalam identifikasi bakteri

Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) agar adalah media selektif dan diferensial. Media ini berisi Eosin dan metilen biru, yang menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan oleh karena itu media ini dipilih untuk bakteri gram negatif. EMBA juga berisi karbohidrat laktosa, yang memungkinkan bakteri gram negatif terdiferensiasi berdasarkan pada kemampuan mereka untuk memfermentasi laktosa.

Pada praktikum pertumbuhan di cawan menunjukkan bakteri Escherichia coli, tidak dihambat oleh Eosin dan methylene biru dan merupakan bakteri gram negatif. Hal ini sesuai dengan pendapat Martutik (2005) warna hijau metalik mengkilat menunjukkan E. coli dapat memfermentasi laktosa menghasilkan produk akhir bersifat asam kuat EMBA merupakan media diferensial berbentuk padat dapat digunakan untuk mengadakan isolasi serta mendeteksi Enterobacteriaceae, E. coli dan campuran spesies-spesies bakteri yang berbentuk batang koliform. Eosin dan methylene blue ini dapat juga berperan sebagai indikator produksi asam.

Vibrio alginolyticus merupakan bakteri penyebab penyakit pada udang yang mampu menyerang bagian-bagian tubuh udang baik di luar maupun di dalam tubuh. Udang yang terserang di bagian luar oleh bakteri tersebut pada umumnya kulit menjadi keropos atau lunak. Keadaan tersebut menyebabkan para ahli perikanan melakukan berbagai penelitian untuk memusnahkan atau mencegah udang terinfeksi bakteri ini. Hasil praktikum  ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut mampu tumbuh pada media TCBS.

Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Widarnani (2007) yang mengatakan bahwa hasil karakterisasi isolat 1 Ub menunjukkan bahwa isolat tersebut memiliki bentuk koloni bulat, tepian licin, elevasi cembung, koloni pada media SWC berwarna kunign, bersifat gram negatif dan sel tunggal berbentuk batang pendek. Sedangkan isolat SKT-b dan Ua adalah bakteri gram negatif, bersifat motil. Berbentuk batang pendek, koloninya berwarna kuning pada media TCBS, dan bersifat menyebar pada media SWC-agar. Hasil analisis sekuen sebagian gen 16-rRNA menunjukkan bahwa isolat 1Ub termasuk speseis Pseudoalteromonas dengan indeks kemiripan 98%, sedangkan isolat SKT-b dan Ua termasuk spesies Vibrio alginoliticus dengan indeks kemiripan masing-masing 88% dan 98%.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

4.1 Kesimpulan

            Praktikum isolasi bakteri dan fungi dari lingkungan akuatik telah berhasil dilakukan dengan metode cawan gores kuadran. Setiap media mempunyai fungsi masing-masing dalam menumbuhkan biakan murni. Secara umum koloni yang terdapat pada biakan murni mempunyai cirri-ciri berbentuk bundar dengan tepian licin dan elevasi cembung.

4.2 Saran

            Wadah yang digunakan untuk medium sebaiknya diperbanyak jumlahnya dan lebih beragam sehingga praktikan dapat lebih mahir dalam pemindahan biakan mikroba secara aseptik

 

DAFTAR PUSTAKA

Admin. 2008. Mikroba http://www.halalguide.info/2008/09/08/mikroba-sang-makhluk-halus/ [23 Desember 2013].

Idafi, M. 2009. Isolasi dan Pemurnian Mikroba. http://www.scribd.com/doc/24543240/Isolasi-Dan-Pemurnian-Mikrobia-Dafi017  [23 Desember 2013].

Iman, MS. 2010. Isolasi dan Pemurnian Mikroba. http://www.scribd.com/doc/39990976/Lap-praktikum-3-Isolasi-Dan-Pemurnian-Mikroba   [23 Desember 2013].

Widarnani, Sukenda, Mia Setiawati. 2007. Bakteri probiotik dalam Budidaya Udang: Seleksi, Karakterisasi, Mekanisme aksi dan Aplikasinya sebagai agen Biokontrol.http://web.ipb.ac.id/~lppm/lppmipb/penelitian/ hasilcari. php?status=buka&id_haslit=HB/018.07/WID/b. [23 Desember 2013]

PENGENALAN ALAT, PENYIAPAN MEDIUM, STERILISASI BAHAN DAN PERALATAN

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Medium merupakan bahan yang disiapkan khusus untuk pertumbuhan, penyimpanan atau transportasi mikroorganisme. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya (Volk dan Wheeler, 1993).

          Media untuk menumbuhkan mikroorganisme dapat berupa media cair, media padat, serta media setengah padat yang disesuaikan dengan keperluan. Medium cair seperti kaldu nutrien atau kaldu glukosa dapat digunakan untuk keperluan pembiakan organisme dalam jumlah besar. Medium padat biasanya digunakan untuk mengamati morfologi koloni dan mengisolasi biakan murni. Media setengah padat dapat digunakan untuk menguji motilitas.

          Sterilisasi peralatan dan bahan juga harus diperhatikan dalam studi mikroorganisme. Hal tersebut dikarenakan ukurannya yang sangat kecil dan keberadaannya yang dapat ditemukan dimana saja, sehingga untuk mengisolasi dan mengkultur suatu mikroorganisme yang diharapkan adalah tidak ada kontaminasi dari mikroorganisme lain.

1.2  Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah mempelajari prosedur umum untuk merekonstruksi (mengembalikan kepada keadaan asalnya) medium berbentuk bubuk (terdehidrasi) dan menaruhnya dalam jumlah yang dikehendaki ke dalam wadah-wadah yang sesuai, serta mempelajari berbagai macam prosedur sterilisasi bahan dan peralatan.

II. METODOLOGI

2.1 Waktu dan Tempat

            Paraktikum ini dilaksanakan pada hari Selasa tanggal 1 Oktober 2013 pukul 07.00-10.00 WIB, bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan, Depertemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

2.2 Alat dan Bahan

          Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung reaksi, bunsen, pipet, cawan petri, plastik, wrap, inkubator, dan oven. Kemudian bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu kertas, tisu, media TSA, alkohol 70%, dan akuades.

2.3 Prosedur Kerja

          Pada praktikum ini, praktikan mendengarkan pengarahan dari dosen mengenai tata tertib praktikum dan kemudian mendengarkan asisten praktikum menjelaskan tentang alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan selama praktikum.

2.3.1 Sterilisasi Cawan Petri

                        Sterilisasi cawan petri dilakukan dengan cara dibungkus dengan kertas. Bagian kertas yang terdapat tulisannya tidak digunakan, karena tinta bekas tulisannya ketika terkena suhu tinggi pada saat di autoklaf dikhawatirkan akan mempengaruhi kinerja sterilisasi tersebut dan mengkontaminasi cawan petri yang akan disterilisasi. Pembungkusan dimulai dengan merentangkan selembar kertas yang masih dapat digunakan salah satu bagian sisinya, kemudian cawan petri diletakan diatasnya tepat ditengah-tengah kertas lalu kertas dilipat menjadi dua dan dilipat lagi setengah dari lipatan pertama. Kemudian dilipat di bagian ujung-ujung kertas sebelah kanan keatas dan bagian kiri keatas sehingga kedua lipatan bertemu dan selanjutnya dilipat ke bawah untuk mengunci hasil lipatan yang telah di lakukan. Lipatan kunci juga dilakukan pada sisi satunya sehingga cawan petri tidak mudah lepas dari pembungkusnya. Setelah dibungkus dengan rapi, cawan petri di masukkan kedalam autoklaf untuk disterilisasi pada tekanan 1 atm selama 15 menit.

2.3.2 Sterilisasi Pipet

                        Air suling dituangkan secukupnya pada autoklaf, kemudian pipet dan cawan petri ditata dengan rapi, tutup autoklaf  diletakan dengan benar, kemudian pengatur klep pengaman dibuka dan dalam keadaan terbuka letak penahan harus lurus, lalu pemanasnya dipasang. Bila uap air keluar dengan deras, klep pengaman ditutup dengan cara pengaturnya didorong. Bila tekanan telah menunjukan 1 atm, pemanasan dikurangi seperlunya. Pertahankan tekanan pada 1 atm selama 15-20 menit. Diakhir proses, pemanasan dimatikan dan ditunggu sampai tekanan kembali nol dan suhu telah turun sampai jauh dibawah 100^oC, pengatur klep dibuka dan ambil peralatan yang tadi disterilkan.

2.3.3 Pembuatan Media

                        Air akuaades 100 ml dimasukan ke dalam gelas ukur, kemudian air tersebut dimasukan ke dalam erlenmeyer yang kapasitasnya dua kali lebih besar dari volume air yang dimasukan. Kemudian timbang bubuk medium NA 4 gram lalu masukan medium ke dalam erlenmeyer yang telah terisi air akuades 100 ml. Supaya medium agar tercampur dengan homogen maka dimasukan ke dalam sentrifuge selama beberapa menit. Setelah itu medium agar dimasukan ke autoklaf untuk disterilisasi selama 15 menit pada suhu 121^oC dan tekanan 1 atm. Setelah suhunya turun medium dituangkan ke dalam cawan petri  dan ke dalam tebung reaksi untuk membuat agar miring.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. Pengenalan Alat

            Mikroskop merupakan alat utama yang digunakan untuk membantu melihat objek yang berukuran mikroskopik.  Bagian bagian mikroskop terdiri atas dua bagian yaitu; optic (okuler, objektif, kondesor, diafragma) dan mekanik (meja objek, penjepit, revolver, pengatur kasar, pengatur halus, pengatur meja mekanis).

Gambar 1. Mikroskop

            Jika ingin menggunakan mikroskop, hal pertama yang dilakukan adalah mengatur cahaya, sehingga lapang pandang menjadi terang demikian pula diafragma dan kondensor. Selanjutnya preparat diletakkan di atas meja objek tepat di bawah lensa objektif, lensa objektif (tubus) kemudian diturunkan hingga titik terendah (lensa tjidak boleh mengenai preparat), secara perlahan pengatur kasar diputar hingga objek terlihat jelas, untuk lebih memperjelas diatur dengan memutar pengatur halus. Sebaiknya perbesaran yang digunakan adalah dari yang paling kecil.

            Autoklaf merupakan suatu alat sterilisasi panas lembab untuk membunuh semua kehidupan yang ada pada alat dan bahan yang akan digunakan. Prosedur penggunaan autoklaf tergantung pada tipe autoklaf yang digunakan.

Gambar 2. Autoklaf

            Prosedur penggunaan autoklaf di Laboratorium Kesehatan Ikan Institut Pertanian Bogor (IPB) adalah sebagai berikut; Susun cawan Petri atau tabung yang akan disterilisasi dan sebelumnya telah dibungkus dengan kertas dengan susunan yang mengikat, hal ini dimaksudkan untuk menghindari tumpahan, kemudian tutup autoklaf dan kunci, nyalakan autoklaf sampai suhu 121⁰C dan dengan otomatis tekanan akan berangsur naik. Pada saat suhu mencapai 121⁰C, matikan autoklaf dan hitung selama 1 menit dengan stopwatch lalu nyalakan kembali. Hal ini dilakukan berulang ulang sampai 15 menit. Autoklaf menggunakan tekanan uap untuk menghancurkan mikroorganisme. Untuk efisiensi transfer panas, uap air mengalirkan udara keluar dari ruang dalam autoklaf (Sultana et al., 2007). 

            Inkubator adalah sebuah alat yang berfungsi untuk mengikubasi mikroorganisme yang telah ditanam pada media.  Suhu dalam inkubator dapat diatur dan konstan.

Gambar 3. Inkubator

            Peralatan kaca meliputi cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur, erlenmeyer, pipet dan sebagainya. Cawan petri adalah wadah media agar untuk menumbuhkan mikroorganisme. Tabung reaksi berguna untuk uji coba reaksi biokimia dan tempat menumbuhkan mikroba. Tabung reaksi ini dapat diisi dengan media padat maupun media cair. Sedangkan gelas ukur, erlenmeyer dan pipet dapat digunakan untuk mengukur, titrasi dan menyimpan bahan kimia.

           

a

Bunsen berfungsi sebagai alat pemanas pada saat bekerja secara aseptik. Bunsen digunakan dengan cara membakar sumbu yang terdapat pada kepala bunsen, apabila sudah selesai digunakan sumbu ditutup dengan menggunakan penutup bunsen.

Gambar 4. Bunsen

            Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan yang akan ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut inoculating needle/transfer needle. Inoculating loop cocok untuk melakukan streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating). Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk mengambil benda dengan menjepit misalnya saat memindahkan cakram antibiotik.

            Bulb berguna sebagai alat bantu dalam pengambilan bahan praktikum. Bulb ini di pasang pada ujung pipet.

Gambar 5. Bulb

3.2 Sterilisasi 

            Sterilisasi adalah proses pemnghancuran segala kehidupan yang terdapat pada alat dan bahan. Cara sterilisasi dapat dibagi menjadi tiga, yaitu : 1). Panas   meliputi basah  (bahan harus dapat ditembus uap air dan tahan terhadap suhu  tinggi  misalnya sterilisasi media dalam autoklaf) dan kering (menggunakan panas tinggi misalnya sterilisasi ose dengan bunsen). 2). Kimia  (menggunakan bahan kimia tertentu seperti alkohol, dan 3). Filtrasi (untuk bahan yang tidak tahan terhadap suhu, misalnya sterilisasi antibiotik dengan  filtrasi). Sementara itu, untuk mendapatkan bakteri yang ditumbuhkan dalam keadaan murni, selain melakukan sterilisasi media sebelum digunakan untuk menumbuhkan bakteri, pembuatan media juga harus dilakukan dengan teknik aseptik, dimana menurut Thomas et al. (2011), teknik aseptik adalah mempertahankan lingkungan yang bersih dari kontaminan dengan bekerja dekat dengan api.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

4.1 Kesimpulan

            Media kultur mikroorganisme memerlukan kandungan zat hara dan lingkungan yang cocok untuk pertumbuhannya. Keberhasilan dalam pembuatan media kultur organism sangat dipengaruhi oleh metode dan cara sterilisasi alat dan bahan yang digunakan untuk menghindari kontaminasi dari organisme lain.

4.2 Saran

            Praktikum selanjutnya masing-masing individu dalam tiap kelompok dapat melakukan praktikum dengan lebih terarah dan tertib

 

DAFTAR PUSTAKA

Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi kelima. Erlangga: Jakarta.

Sultana, Y. and Jamia H. 2007. Pharmaceutical Microbiology And Biotechnology Sterilization And Principles. [terhubung berkala] http://nsdl.niscair.res.in/bitstream/123456789/704/1/revised+sterilization+methods+and+Principles.pdf. [20 Oktober 2013]

Thomas, M., Mardiah, Mustafa, dan Abdi Santosa. 2011. Teknik Isolasi dan Kultur.[terhubung berkala] http://openwetware.org/images/4/4b/Kuliah_7_tambahan_MEDIA_KULTUR.pdf. [20 Oktober 2013]